Um 1231 stiftete Agnes’ Bruder, König Wenzel I., Land für den Bau eines Konvents und des St.-Franziskus-Hospitals, das 1233 erstmals erwähnt wird. In dieser Zeit trafen die ersten Nonnen aus dem italienischen Konvent San Damiano nahe Assisi ein. Ihnen schlossen sich sieben Jungfrauen aus dem böhmischen Hochadel an.
1234 legte Agnes aufgrund gescheiterter dynastischer Heiratspläne des Böhmenkönigs ihr Klostergelübde ab und das Kloster erhielt bedeutende Privilegien. Es stand nun unter dem Patronat von König Wenzel I. sowie Papst Gregor IX. Agnes, die für ihre enthaltsame und demütige Lebensweise bekannt war, wurde 1235 als Äbtissin eingesetzt. Bereits 1237 legte sie dieses Amt wieder nieder, verlor aber nicht an Einfluss auf das Klosterleben.
Bis 1240 entstand das Männerkloster der Franziskaner Na Františku, das den Regeln des heiligen Augustinus folgte, und wurde dem Klarissenkloster zugeordnet. König Wenzel I., der 1253 verstarb, wurde im Presbyterium der St.-Franziskus-Kirche beigesetzt. Sein Nachfolger, Ottokar II. Přemysl, übernahm nun die Schirmherrschaft des Klosters. Prinzessin Agnes starb 1282. Sie fand in der Jungfrau-Maria-Kapelle ihre letzte Ruhestätte.
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